Sonic and Knuckles conserve le gameplay des premiers épisodes : c'est un jeu de plates-formes basé sur la vitesse où aucune vie n'est perdue tant que le personnage possède au moins un anneau (ring). Il n'est pas possible de sauvegarder lorsque le personnage n'a plus de vie, il recommence alors du premier niveau.

Dans sa version simple (c'est-à-dire sans l'adjonction de Sonic 3), Tails a disparu, mais Knuckles est jouable totalement indépendamment de Sonic. Ses capacités à planer, à s'accrocher aux parois et à casser certains murs lui permettent d'explorer les niveaux suivant un chemin différent de celui de Sonic. Dans certains cas, Sonic et Knuckles font face à une variante du niveau. De plus, la difficulté des rencontres avec les boss est largement augmentée avec Knuckles, quand le boss n'est pas complètement différent (Knuckles sautant moins haut que Sonic).

Le système de bouclier hérité de Sonic 3 est conservé. Sonic peut obtenir 3 boucliers différentes. Le bouclier de feu lui permet de résister au feu, à la lave et aux tuyères de réacteurs des différents ennemis et boss. Il permet aussi d'effectuer une puissante attaque horizontale. Le bouclier d'eau lui permet de respirer sous l'eau et d'attaquer verticalement. Le bouclier magnétique permet d'attirer les anneaux à proximité, permet l'utilisation d'un double saut et protège des attaques de feu. Knuckles peut aussi disposer de ces boucliers, mais il ne peut pas utiliser leurs capacités de mouvements spéciaux. Ces trois boucliers protègent aussi de certains projectiles lancés par les ennemis.